如何避免显色液添加与混合不均的问题？

一、前期准备：工具与试剂的规范处理
选择合适的加样工具
优先使用8 通道或 12 通道移液器（匹配多孔板规格），避免单通道移液器逐孔添加导致的时间差和体积偏差；移液器需提前校准（误差≤1%），确保每孔添加体积一致（如说明书要求 100μL，实际波动不超过 ±2μL）。
加样枪头选用低吸附枪头，减少显色液在枪头内壁的残留，避免因残留导致的孔间添加量差异；枪头一次性使用，严禁重复使用或交叉接触不同试剂。
显色液的预处理
显色液（如 TMB 底物）需按说明书要求复温至室温（18-25℃），避免低温导致的液体粘度变化影响加样均匀性；复温后轻轻颠倒试剂瓶 3-5 次，混匀内部成分（避免剧烈震荡产生气泡）。

若需分装显色液，使用无菌无酶的 EP 管，分装过程中保持枪头垂直，避免接触管壁；分装后立即盖紧 EP 管盖子，防止氧气干扰或污染，分装后 1 小时内完成加样。

二、核心操作：添加与混合的标准化流程
显色液添加的精准操作
加样时保持移液器垂直，枪头尖端距离孔底 1-2mm，直接滴加到孔底中央区域，避免滴在孔壁上方（孔壁残留的显色液无法充分反应，还可能因后续震荡集中反应导致局部信号异常）。
逐行 / 逐列匀速添加：按 “先列后行” 或 “先行后列” 的固定顺序加样，每孔加样时间控制在 1-2 秒，避免部分孔先加、部分孔后加导致的反应时间差；加样过程中避免移液器倾斜，防止液体挂壁或飞溅。
避免气泡产生：吸液时缓慢松开移液器按钮，排液时速度均匀，若枪头内出现气泡，需重新吸液；若加样后孔内出现气泡，用干净枪头轻轻刺破（避免触碰孔底反应膜）。
混合操作的温和高效执行
加样完成后，立即将多孔板置于微孔板振荡器上，设置震荡参数：频率 300-500rpm，时间 30-60 秒，确保显色液与孔内酶标物充分接触（震荡力度以液体不飞溅为准，避免剧烈震荡导致孔间交叉污染）。
无振荡器时，可手动温和混匀：用手指捏住多孔板边缘，沿水平方向轻轻晃动 5-8 次（幅度≤2cm），确保每孔液体形成轻微漩涡，避免垂直晃动导致液体溅出。
混匀后检查：观察每孔液体是否均一，无明显液滴挂壁、无局部浓度差异；若发现孔壁有残留液滴，可轻轻甩板（力度轻柔），使液滴回流至孔底。
三、细节把控：避免干扰的关键注意事项
操作环境的稳定控制
加样与混合过程中，保持实验台面平稳，避免碰撞、震动（如远离离心机、振荡器等设备）；环境温度控制在 20-25℃，湿度 40%-60%，避免温度骤变导致液体粘度变化。
显色液对光线敏感（如 TMB），加样与混合时避免暴露在强光下（如阳光直射、荧光灯近距离照射），可在暗室或遮光盒内操作。
孔间交叉污染的预防
加样时枪头不得接触孔壁、孔内液体或其他孔的边缘，若不小心接触，需立即更换枪头；加样完成后及时盖好多孔板盖板，避免液体飞溅。
混合后若发现孔内液体溢出，需用无菌吸水纸轻轻吸干板边缘残留液体，切勿触碰孔内反应液。
重复验证与质量控制
每次实验设置空白对照孔（仅加显色液和终止液）和阴性对照孔，通过对照孔的 OD 值判断显色液添加与混合是否均匀（对照孔 OD 值应一致且在正常范围）。
若出现部分孔 OD 值异常偏高，可重复加样与混合步骤，排查是否因操作不当导致；若多次出现不均问题，需检查移液器校准情况、显色液是否变质。